Bengkak penuh damar
Timbang 2.0 g resin Wang kosong dalam tiub tindak balas yang bersih dan kering, tambah 15 mL DMF, Pengaktifan suhu bilik 30 minit kira-kira.
Ambil asid amino pertama
Pada suhu bilik, tapis keluar pelarut daripada langkah sebelumnya melalui teras pasir dan tambahkan 1 mmol 5 molar lebihan C Asid amino pertama di hujung, DMAP lebihan molar 5 kali ganda, DIC lebihan 5 molar, DMF Lakukan tindak balas suhu bilik pelarut 3 h. Gunakan selepas tindak balas selesai DMF Wash 4 ~6 kali, 5-6 kali setiap kali mL. Kemudian tambahkan jumlah piridin dan anhidrida asetik yang sesuai dengan nisbah isipadu 1:1, dan bertindak balas selama 30 minit. Gunakan selepas tindak balas selesai DMF Wash 4 ~6 kali, 5-6 kali setiap kali mL. (kesan: Sekat titik mikro aktif pada resin kosong yang tidak aktif.)
Fmoc Berlepas kumpulan pelindung
Keluarkan pelarut dari langkah sebelumnya dengan penapisan sedutan, dan tambah 10 mL 20% piperidine DMF Larutan ditambah kepada resin, N2 Kacau 10 min Akhir sekali, tapis larutan dan tambah 10 mL 20% larutan piperidine DMF, N2 Tiup dan kacau 5 min Kemudian tapis larutan dan ulangi operasi ini dua kali. DMF Basuh 4 kali, basuh 2 kali dengan metanol, 5-6 kali setiap kali mL.
Menguji kesan penyingkiran ninhidrin
Keluarkan sedikit resin, basuh tiga kali dengan metanol, tambah ninhidrin, KCN, Satu titisan setiap larutan fenol, 105 darjah –110 darjah Pemanasan 5 min, Menjadikan biru tua adalah tindak balas positif, menunjukkan bahawa penyingkiran selesai dan langkah tindak balas seterusnya boleh dijalankan.; Jika ia tidak berwarna, ini bermakna kumpulan pelindung belum dialih keluar sepenuhnya, dan operasi penyahlindungan di atas perlu diulang.
Kemudian asid amino kedua dan penyingkiran kumpulan Perlindungan Fmoc
Timbang 3 kali lebihan molar C Asid amino kedua di hujungnya, lebihan HBTU molar 3 kali ganda dan lebihan molar 3 kali ganda HOBT Dalam tiub tindak balas, tambah jumlah DMF yang sesuai Selepas larutan benar-benar larut, tambahkan lebihan molar 10 kali ganda (tulen) DIEA, Tindak balas suhu bilik 40 min, gunakan ~ DMF-6 kali Cuci 4 kali. Ambil sedikit penggunaan resin Uji dengan reagen pengesan ninhidrin dan ia akan kelihatan tidak berwarna, kemudian tambah 10 mL 20% piperidine DMF Solution penyingkiran Fmoc, Lakukan ini dua kali selama 10 min, 5min, selepas menggunakan DMF Basuh 4 kali, basuh 2 kali dengan metanol, 5-6 kali setiap kali mL. Keluarkan sedikit penggunaan resin Gunakan reagen pengesan ninhidrin untuk mengesannya. Jika pengesanan berwarna biru, anda boleh meneruskan ke langkah seterusnya tindak balas.
Secara analogi, ulangi langkah 2.6 sehingga sintesis adalah N Keluarkan asid amino terakhir di hujung bes Fmoc Protect, kemudian toskan.
Penumpahan resin dan pengasingan dan pengesanan produk tulen
Akhir sekali, gunakan larutan pemotongan asid trifluoroasettik (95% TFA:2% TIS:2% EDT:1% H2O) Potong 2 jam, Tapis larutan tindak balas dengan sedutan dan dapatkan larutan asid trifluoroasettik polipeptida. Keringkan lysate dengan nitrogen sebanyak mungkin, mendakan dengan eter, sentrifuge, dan kemudian basuh dengan eter selama 3 saat. ~ 5 kali, pepejal putih diperolehi. Selepas melarutkannya dalam air tulen, HPLC Desal dan tulen, bekukan{11}}hablur kering dan mendakan, ambil sedikit analisis MS.